Die ThULB verwahrt rund 3.400 Handschriften, etwa ein Zehntel davon mittelalterlich. Neben den üblicherweise abendländischen lateinisch- und deutschsprachigen sind in kleinerem Umfang französischsprachige, griechische, hebräische sowie außereuropäische (u.a. arabische, persische, türkische) Handschriften vorhanden. Die Signaturengruppen spiegeln zumeist Provenienzen. Die wertvollsten Handschriften der ThULB gehen auf die Sammlungen der Wittenberger Bibliotheca Electoralis (Ms. El.) und des Jenaer Historikers Johann Andreas Bose (1626–1674; Ms. Bos.) zurück. Neben größeren Beständen aus dem Vorbesitz des Jenaer Juristen und Historikers Christian Gottlieb Buder (1693–1763; Ms. Bud.), des Goethe-Enkels Wolfgang Maximilian von Goethe (1820–1883; Ms. G.B.) und des Jenaer Historikers Caspar Sagittarius (1643–1694; Ms. Sag.) befinden sich Handschriften des Orientalisten Georg Heinrich Bernstein (1787–1860; Ms. Bernstein), des Erfurter Beamten Paul Christian Birkner († 1742; Ms. Birkner) und des Barons Carl von Bjelke (Ms. Bjelke) in der Sammlung. Auf Körperschaften bezogene Signaturengruppen sind Ms. Soc. Thur. und Acta Soc. Thur. (Handschriften bzw. Akten des Vereins für Thüringische Geschichte und Altertumskunde) sowie Ms. Conc. Akad. (Noten der Jenaer Akademischen Konzerte). Die größte und inhaltlich heterogenste Gruppe bilden die "Manuscripta Provisoria" (Ms. Prov.). Die übrigen Gruppen sind Ms. App. (Appendix Manuscriptorum), Ms. rec. adj. (Manuscripta recens adjecta), Chorbuch (Chorbücher), Ms. Chron. (Chronologische Signaturen), Ms. Fragm. (Fragmente), Ms. Klosterbibl. (teilweise aus Jenaer Klöstern), Ms. Membr. N.S. (Pergamenthandschriften aus neueren Ankäufen), Ms. Mus. (Musikalia), Ms. Palm. Sg. und Ms. Tam. (Palmblatthandschriften, singhalesisch bzw. tamilisch) sowie Stb. (Stammbücher).
Mehrere der etwa 350 mittelalterlichen Handschriften des 9. bis frühen 16. Jh. haben herausragende Bedeutung, so vor allem die Jenaer Liederhandschrift mit etwa zur Hälfte nur in ihr erhaltenen, mit Notation versehenen deutschen Sangsprüchen des 13./14. Jh. (Ms. El. f. 101; um 1330), das illuminierte deutschsprachige Jenaer Martyrologium (Ms. Bos. q. 3; spätes 13. Jh.), eine illustrierte Abschrift der Weltchronik Ottos von Freising (Ms. Bos. q. 6; 2. Hälfte 12. Jh.) und das Autograph der Weltchronik Frutolfs von Michelsberg (Ms. Bos. q. 19; 1099/1106). Hervorzuheben sind außerdem ein Quedlinburger Evangeliar mit elfenbeingeschmücktem Einband (Ms. El. f. 3; um 1000), das Fest-Evangelistar und das Fest-Epistolar Friedrichs des Weisen (Ms. El. f. 1-2; 1507), zwölf teils aufwendig illuminierte französischsprachige Handschriften des 14./15. Jh. aus der Bibliotheca Electoralis (Ms. 80–82, 85–92, 95/96) sowie die mit elf Exemplaren weltweit größte Sammlung illuminierter flämischer Chorbücher aus der Werkstatt des Petrus Alamire mit Vertonungen u.a. von Josquin Desprez, Johannes Ockeghem und Pierre de la Rue (Chorbuch 2–5, 7–9, 12, 20–22; frühes 16. Jh.). Die Handschrift Ms. Bos. o. 1 (1459/72) stammt aus der 2005 von der UNESCO zum Weltdokumentenerbe (Memory of the World) erhobenen Bibliotheca Corviniana.
Der Bestand an neuzeitlichen Handschriften seit dem 16. Jh. verdankt sich in erster Linie der Sammeltätigkeit Jenaer Professoren und Gelehrter. Hinzu kommen Bestände verschiedener Jenaer akademischer Institutionen und Körperschaften. Das Segment vor 1800 betrifft vor allem Reichs- und Landtagsakten, Kopialbücher, Lehenssachen und andere Juridica sowie Schriften zur sächsisch-thüringischen Landesgeschichte wie etwa Landes- und Städtechroniken, städtische Statuten, Genealogien oder Erbverträge und Heiratsakten ernestinischer Häuser. Ein Schwerpunkt liegt auf Materialien aus dem Kontext der Universität Jena, vornehmlich des 19. und 20. Jh., aber bis in die frühen Universitätsjahre zur Mitte des 16. Jh. zurückreichend: handschriftliches akademisches Schrifttum wie Vorlesungs- und Vortragsskripte oder Rechtsgutachten. Hervorzuheben sind das Stiftungsprivileg der Universität von 1557, die ersten Statuten und die handschriftlichen Matrikel und Studentenalben der Hohen Schule bzw. Universität Jena von 1548 bis 1923 sowie über 160 studentische Stammbücher des 16. bis 19. Jh. Reformationsgeschichtlich sehr wichtig sind die Handschriften aus der 1557 in die Bibliothek gelangten Sammlung Georg Rörers (1492–1557).
Digitalisate und Beschreibungen Jenaer Handschriften bieten vor allem die Portale Collections@UrMEL und kulthura; außerdem: